血液からのDNA抽出

鶏(ウズラ)からの採血

凝血防止液(生食EDTAあるいは血液凝固防止剤)を15ml遠沈管に12ml程度入れておきます。。

凝血防止液(生食EDTAあるいは血液凝固防止剤)をシリンジに1.0ml取り、空気を出します。

採血は2人1組で行い、1人はしっかりと保定します。もう1人は翼状静脈から採血します。静脈に並行に針を入れ、その後で静脈の方へ針を刺して軽く引きます。

血液がシリンジに入ってきたらゆっくりと引いて血液を採取します。

ウズラの場合は血管が破れやすいので注意します。 1.0ml程度採取できれば針を抜き、軽く転倒混和します。

シリンジの目盛を読み、15ml遠沈管に採血年月日、系統名、個体番号、性別、血液量を油性マジックで書き込み、シリンジの血液を遠沈管に注ぎ、転倒混和します。

遠沈管は冷蔵庫で立てて保存します。冷凍保存する時は数時間冷蔵庫または室温で立てて放置した後、-20度のメディカルフリーザーに移します。 長期に保存する場合には、2mlのクライオチューブに分注後、-85度のストッカーに移します。

キットを用いた血液からのDNA採取

このキットは塩析法を用いています。塩析法の基本実験は生産生物学実験実習Iで行っています。

• 1.5mlチューブにCell Lysis Solution 600マイクロをサンプル数だけ分注する
• ヘパリン処理鳥類全血（末梢血）12マイクロを上記チューブに加え、３−５回ピペティングする。 この時に凝血部分を入れないように注意する。
• cell clumpがなくなるまで３７度で時々転倒混和しながらインキュベートする。
• サンプルを室温に戻し、Protein Precipitation Solution200マイクロをチューブに加える。
• ２０秒間激しくボルテックスしてcell lysisを均一化した後に、15000gで３分間遠心する。
• その間にエアーインキュベータを６５度にセットしておく。
• 新しい1.5mlチューブに遠心後のチューブの上清を移す。
• 600マイクロの100%イソプロパノールを加えて５０回、転倒混和する。
• 15000gで１分間遠心する。
• 上清をきれいに取り除き、チューブの蓋をあけたままキムワイプの上に立てて軽くたたき、蓋のまわりのアルコールを取り除く。
• 300マイクロの70%エタノールを加えて、３回転倒混和し、15000gで１分間遠心する。
• 注意深く上清を取り除き、先ほどと同様に蓋のまわりのアルコールを取り除き、蓋をあけたまま１５分間、室温で風乾する。
• DNA Hydration Solution 50マイクロを加えて、軽くボルテックスし、スピンアウトして６５度のエアーインキュベータで１時間インキュベートする。
• 抽出したDNAを分光測定し、４度またはマイナス２０度で保存する。

後かたづけ

• 試薬類、マイクロピペット、チップラックなどを元に戻します。
• ピペットチップ、最初に使った2mlのチューブの中身を大量の水とともに流し、よく水洗いします。
• 2つのガラス瓶も中身を大量の水とともに流し、よく水洗いします
• クリーンベンチ内をDW水を含んだペーパータオルで拭き、10分程度紫外線殺菌灯を点灯します。

最終更新年月日 2003年7月11日

佐賀大学　農学部　動物生産学分野　和田研究室

ywada@cc.saga-u.ac.jp