動物組織からのDNAの抽出 ニワトリのDNAを見てみよう

今回は、塩析法（森田法）を用いてニワトリの肝臓細胞からDNAを抽出します。 最初に中性洗剤で細胞を分解し核からDNAを溶出させます。次に高濃度の食塩水を加えて加熱し、 タンパク質などとDNAを分離します。 最後にDNAがエタノールに溶けない性質を利用してDNAを精製します。

抽出したDNA溶液を電気泳動してチェックします。

火を扱うので火傷をしないように十分、注意してください！
エチジウムブロマイドは発ガン物質です。素手でゲルに触れないでください。

用意するもの（８班分）

実験手順

• サンプルの凍結粉砕
  • 各班の湯煎に水を入れて、ガスバーナーをつけて湯をわかす。
  • 冷凍したニワトリの肝臓（レバー）100g、中性洗剤液150ml、氷50gをミキサーに入れて、２分程度粉砕する。
  • 200mlのビーカーに50mlずつ分注し、各班に配る。
• DNA分解酵素の失活、DNAの塩析
  • 2M NaClを50ml加えて、軽くかきまぜる。
  • 湯煎の中にビーカーを入れる。突沸に注意！　時々、軽くかきまぜる。
  • タンパク質が凝固して、液の色が白色になったら火を止めて、ビーカーを湯煎から出してさます。
  • 十分さめてから、４枚重ねのガーゼで絞って別の200mlビーカーに30ml程度、濾過する。
• エタノール沈殿
  • 濾液を氷水で冷やしてから、冷エタノール約90mlを静かに加える。
  • ガラス棒で軽くかきまぜながらDNAを巻き取る。　エタノールはなるべく取り除くこと。
• 2回目の塩析
  • 別の100mlビーカーに巻き取ったDNAを移し、2M NaClを30ml加えてよく溶かす。
  • 各班の湯煎に水を入れて、ガスバーナーをつけて湯をわかす。
  • 湯煎して、DNAを良く溶かす。
  • ロート台、ロート、ろ紙を使って、熱いうちにDNA溶液を濾過する。
• 2回目のエタノール沈殿
  • 濾液をよく冷やしてから、冷エタノール60mlを静かに加える。
  • ガラス棒で軽くかきまぜながらDNAを巻き取る。　エタノールはなるべく取り除くこと。
  • 1.5mlエッペンチューブに巻き取ったDNAを移す。
  • 純水800μlでDNAを溶かす
• 電気泳動
  • 0.5xTBEを約450ml作る
  • 泳動槽にゲルをセットし、0.5xTBEをウエルを洗うように入れる
  • λHindⅢマーカーを5μlアプライする（TA)
  • ローディングダイ2μlとDNA溶液5μlをよく混合して、アプライする
  • 通電し、20分程度泳動する
  • UV撮影装置で写真を撮る（研究室）
• DNA溶液の分光測定（研究室）
  • 純水を分光セルに入れてブランクを取る
  • DNA溶液を20倍に薄めて分光測定する
• あとかたずけ
  • ビーカー、ガラス棒、湯煎、ミキサーは洗剤でよく洗い、水道水で洗剤を完全に洗い流してから、純水でリンスする。
  • DNA溶液を-20度のフリーザーに保存する。

考察のポイント

• DNAの濃度と純度はどのくらいか？
• もっと濃度と純度を上げるにはどうすれば良いか？

最終更新年月日 2011年5月30日

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