ゲルからのDNA抽出

これらはTAクローニングやシーケンス決定にとって障害になりますので、 目的のバンドのDNAのみを抽出する必要があります。

今回は、タカラバイオのRECOCHIPを用いたバンドDNAの抽出を行います。 RECOCHIPは不織布と透析膜を加工した小さな板状のもので、 DNAバンドの正極側のゲルに差し、電気泳動によりDNAをチップ内にトラップします。 トラップしたDNAを遠心により回収し、エタノール沈殿で精製します。

実験手順

• 1.2％アガロースゲル（0.5xTBE)を作成する
• PCR産物（10μl)とローディングダイ（3μl）をウェルにアプライする
• 100bpラダーマーカー（5μl）をアプライし、電気泳動する
• 適当に泳動したら紫外線をあててバンド位置を確認し、正極側のゲルに黒色面をバンド側にしてRECOCHIPを差し込む
• ５分程度泳動したらRECOCHIPを取り出し、付属のチューブに入れて5000rpm　1分遠心する
• RECOCHIPを取り出し、3M酢酸ナトリウム（5μl）、20mg/mlグリコーゲン溶液（1μl）、 100%エタノール（1ml）を入れて、30回転倒混和する
• メディカルフリーザーで10分間静置する
• ４℃15000rpmで20分間遠心する
• 上清をマイクロピペットでていねいに取り除き、70%エタノールを300μl加えて、４℃15000rpmで遠心する
• 上清をマイクロピペットでていねいに取り除く
• 遠心エバポレータで37度４分間乾燥する（静電気で白沈が飛び出すことがあるので注意すること）
• 精製水25μlを加えて沈殿をとかし、常温で１０分間静置する
• サンプル5μlを精製水で10倍に薄めて、分光光度計でDNAの濃度と純度を測定する

最終更新年月日 2006年1月12日

佐賀大学　農学部　動物生産学分野　和田研究室

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